Germania: design innovativo dell’impalcatura stampata in 3D per l’ingegneria osteo-conduttiva del tessuto osseo
I ricercatori tedeschi affrontano ulteriori sfide e complessità nell’ingegneria dei tessuti, rilasciando le loro scoperte nel recente pubblicato ” Stampa 3D di impalcature di ingegneria del tessuto osseo gerarchicamente progettate e osteoconduttive “.
La bioprinting e l’ingegneria dei tessuti continuano a rappresentare una delle principali aree di sfida per i ricercatori e i professionisti medici che cercano di migliorare la vita dei pazienti che richiedono un trattamento critico. Oggi, le impalcature svolgono un ruolo enorme nell’ingegneria dei tessuti e gli scienziati hanno condotto un’ampia varietà di studi, sia per quanto riguarda la rigenerazione della cartilagine , la crescita dei tessuti dopo le mastectomie , sia l’ulteriore sperimentazione di materiali . In questo ultimo studio, gli scienziati si occupano dell’ingegneria del tessuto osseo (BTE) per il trattamento dei difetti ossei di grandi dimensioni (LBDT), sviluppando una nuova architettura di impalcature per sostituire l’osso.
Poiché le alternative di trattamento sono “urgentemente necessarie”, gli autori cercano il miglior sostituto per stimolare sia la formazione ossea che vascolare. Le impalcature devono possedere le seguenti qualità:
Stabilità meccanica
capacità di assorbimento
Proprietà osteoconduttive
Proprietà osteoinduttive
Caratteristiche angiogeniche
citocompatibilità
“Sebbene esistano promettenti soluzioni di scaffold per il trattamento di difetti di dimensioni critiche in piccoli animali e in vitro, solo occasionalmente sono state documentate applicazioni di successo in modelli di animali di grandi dimensioni e non esistono innovazioni significative per i sostituti ossei disponibili in commercio”, hanno affermato i ricercatori.
L’ingegneria dei tessuti nel complesso è ovviamente una scienza difficile, ma poiché ostacoli particolari risiedono nella rigenerazione ossea, ricerche precedenti hanno dimostrato che il processo deve essere considerato in modo completo, non solo in “aspetti parziali”. Le cellule devono essere fornite di sostanze nutritive, ossigeno e anche le cellule in luoghi diversi devono essere tenute in debita considerazione, come le cellule situate centralmente che possono avere una scarsa scorta di ossigeno.
I ricercatori hanno utilizzato il PLA per rafforzare la fase originale di rigenerazione, consentendo un facile adattamento a difetti più grandi. È stato utilizzato un approccio a cinque livelli, che offre stabilità meccanica insieme a un adeguato apporto di ossigeno e nutrienti per le cellule.
I campioni per lo studio sono stati fabbricati tramite la stampa 3D FFF su Anet A6 e quindi caratterizzati sia in vitro che meccanicamente.
“Mentre la velocità di stampa di base era impostata su 40 mm / s, a seconda dell’area di contatto dell’impalcatura con il letto, una zattera o una gonna sono state utilizzate per una migliore adesione”, hanno spiegato i ricercatori. “Quindi, l’impalcatura è stata prodotta con un’altezza dello strato di 100 µm e distanze di retrazione di 5 mm. Per disinfettare l’impalcatura, è stata immersa nel 70% vol. alcool per 10 minuti e successivamente essiccato per 10 ore in una piastra da 12 pozzetti. “
Livelli della struttura in dettaglio (per una migliore illustrazione dei dettagli della struttura è stato utilizzato il PLA colorato): (a) Primo piano di una colonna centrale. Al centro è visibile la rete filamentosa. La stampa in rete tramite estrusione controllata, utilizzata per la stampa sulla parete circostante, non era possibile. I parametri di stampa dovevano essere regolati. Il flusso è stato ridotto e la distanza tra i singoli filamenti è stata aumentata da 0,1 a 0,3 mm. Sebbene le strutture filamentose siano discontinue, offrono pori nell’intervallo inferiore a 100–150 µm e un elevato rapporto superficie / volume. (b) Immagine assiale della struttura a colonna cava singola. Per una migliore illustrazione della struttura fine porosa del muro, manca l’anello di base solido. (c) Unità base di questo concetto: l’immagine a colonna singola che abita le reti filamentose. Le reti sono facilmente accessibili attraverso le pareti porose di diametro variabile. (c, d) Otto colonne vuote formano una subunità dell’impalcatura. Nella parte inferiore e superiore, gli anelli di base offrono stabilità per una trasduzione della forza regolare. Inoltre, l’anello è l’origine delle strutture filamentose di Livello 2, mostrate in (a). (c, d) Le subunità possono essere combinate tramite un sistema di morsetti in outsourcing. Le rigide strutture a traliccio erano ricoperte da pareti porose, per garantire porosità nell’intervallo di 300-1500 µm. (f) Alternativa di progettazione stampata in 3D: Progettazione 2. (g) Una struttura altamente porosa con un canale centrale verticale e orizzontale e quattro cilindri cavi simmetrici di rotazione. La struttura consisteva in colonne che fungevano da subunità, che erano combinate per mezzo di un piccolo piedistallo con un anello sul fondo e sulla parte superiore. (h) Dimensioni del secondo disegno. (i, j) Microstrutture di ponteggi in PLA non trattati in SEM. Le aree intercolonna dei filamenti offrono spazi stretti (i) e fessure di raffreddamento strette (j). (k) Verifica della resistenza a compressione assiale di tre progetti strutturali e diametro caratteristico dei montanti rispetto alla resistenza a compressione. I test sono stati eseguiti con colonne vuote singole (diametro: 5 mm; altezza: 5 mm) (c). Infine, è stato scelto un compromesso tra resistenza e volume del materiale. Gli esperimenti sono stati effettuati una sola volta per la verifica del progetto. In futuro, deve essere effettuata una validazione della struttura con il progetto finale. Per adattare un’impalcatura alla dimensione di un difetto osseo di dimensioni critiche, qualsiasi numero di colonne cave può essere successivamente combinato su una piastra di base comune. Il carico viene quindi distribuito uniformemente. (k) Verifica della resistenza a compressione assiale di tre progetti strutturali e diametro caratteristico dei montanti rispetto alla resistenza a compressione. I test sono stati eseguiti con colonne vuote singole (diametro: 5 mm; altezza: 5 mm) (c). Infine, è stato scelto un compromesso tra resistenza e volume del materiale. Gli esperimenti sono stati effettuati una sola volta per la verifica del progetto. In futuro, deve essere effettuata una validazione della struttura con il progetto finale. Per adattare un’impalcatura alla dimensione di un difetto osseo di dimensioni critiche, qualsiasi numero di colonne cave può essere successivamente combinato su una piastra di base comune. Il carico viene quindi distribuito uniformemente. (k) Verifica della resistenza a compressione assiale di tre progetti strutturali e diametro caratteristico dei montanti rispetto alla resistenza a compressione. I test sono stati eseguiti con colonne vuote singole (diametro: 5 mm; altezza: 5 mm) (c). Infine, è stato scelto un compromesso tra resistenza e volume del materiale. Gli esperimenti sono stati effettuati una sola volta per la verifica del progetto. In futuro, deve essere effettuata una validazione della struttura con il progetto finale. Per adattare un’impalcatura alla dimensione di un difetto osseo di dimensioni critiche, qualsiasi numero di colonne cave può essere successivamente combinato su una piastra di base comune. Il carico viene quindi distribuito uniformemente. è stato scelto un compromesso tra resistenza e volume del materiale. Gli esperimenti sono stati effettuati una sola volta per la verifica del progetto. In futuro, deve essere effettuata una validazione della struttura con il progetto finale. Per adattare un’impalcatura alla dimensione di un difetto osseo di dimensioni critiche, qualsiasi numero di colonne cave può essere successivamente combinato su una piastra di base comune. Il carico viene quindi distribuito uniformemente. è stato scelto un compromesso tra resistenza e volume del materiale. Gli esperimenti sono stati effettuati una sola volta per la verifica del progetto. In futuro, deve essere effettuata una validazione della struttura con il progetto finale. Per adattare un’impalcatura alla dimensione di un difetto osseo di dimensioni critiche, qualsiasi numero di colonne cave può essere successivamente combinato su una piastra di base comune. Il carico viene quindi distribuito uniformemente.
La struttura del tessuto osseo consisteva in micro-, meso- e macrostrutture intese a offrire “applicabilità e uso chirurgico in condizioni cliniche”. I livelli da uno a quattro variano in porosità e struttura, mentre il livello cinque è responsabile della connessione delle subunità, da mettere insieme dal chirurgo quando vengono impostate le dimensioni dell’impalcatura, a seconda della dimensione del difetto osseo.
Parametri di stampa ottimizzati per strutture di rete filamentose rispetto ai parametri di stampa a parete.
Penetrazione del sangue e formazione di ematoma in entrambi i modelli di impalcatura: ogni impalcatura è stata immersa nel sangue nativo non trattato per 30 s. (a) Vista assiale del disegno 2 dopo la rimozione del coperchio frontale. (b) Vista assiale del disegno 1. (c) Vista laterale del disegno 2. (d) Vista laterale del disegno 1. Sono stati combinati due ponteggi. La connessione tramite un sistema di serraggio esterno è chiaramente visibile. Le foto sono state scattate dopo 3 ore di incubazione. È possibile vedere una bagnatura completa di tutte le superfici dell’impalcatura. La formazione di ematoma in entrambi i ponteggi è visibile nei grandi canali verticali (a, b) e orizzontali (c, d).
A causa della natura complessa delle impalcature, i ricercatori hanno capito che potevano essere fabbricati solo tramite processi AM. I ponteggi campione sono stati progettati in forme cilindriche a causa delle aree della sezione trasversale dell’osso, insieme ad aspetti tecnici di base. Ci sono stati problemi, tuttavia, poiché non è stato possibile impostare le gamme di pori necessarie. Per risolvere il problema, i ricercatori hanno riempito le aree tra i montanti.
“Il trapianto di una struttura di colonna cava porosa di dimensioni simili, stampata in 3D, in un difetto di 5 mm stabilizzato sulla placca nel femore del ratto da due autori di questo studio ha mostrato risultati promettenti di guarigione”, hanno spiegato i ricercatori. “È ipotizzabile il trasferimento su un modello animale di grandi dimensioni, poiché i dati attuali indicano che impalcature basate sulla fabbricazione di filamenti fusi stampati in 3D possono essere efficaci per il trattamento di difetti ossei di grandi dimensioni in animali di grandi dimensioni.”
“Per progetti diversi, erano necessari protocolli di stampa personalizzati. Infine, un sistema con staffe a scatto esterne o interne si è rivelato ottimale in termini di stabilità rotazionale, resistenza alla flessione, stabilità torsionale, stampabilità ed effetto sulle strutture bioattive. Per la connettività, le staffe sono state combinate con i pannelli leggeri e stampate come strutture solide. Per evitare spigoli vivi, le transizioni tra le piastre e le spine sono state arrotondate. “
Esperimenti di adesione cellulare. Cellule Saos-2 seminate su impalcature di PLA non colorate pretrattate con rivestimento proteico di adesione: (a, b) È visibile la crescita delle cellule Saos-2 negli strati intercolonna e pori macroscopici. (c, d) colorazione CFSE di superfici PLA pretrattate native e CellTak. (c) Superficie nativa senza precondizionamento. Solo poche celle erano aderenti. (d, e) Le superfici precondizionate di CellTak hanno mostrato una maggiore adesione cellulare. (f, g) colorazione CFSE / DAPI del ponteggio rivestito con cellule Saos-2 (Design 2); le cellule appaiono verdi (CFSE) con nucleo blu (DAPI). (f) Stringendo in un poro coperto di cellule vitali. (g) Onsight su un poro con struttura di tesatura. Su tutte le caratteristiche strutturali sono visibili più cellule vitali. (h) Conteggio delle cellule calcolato sulla base dei risultati del test MTT dopo 1, 7, 14 e 21 giorni.
Nel complesso, i risultati dello studio, offrendo nuovi concetti strutturali e design, sono stati considerati promettenti dal team di ricerca. Sono stati in grado di integrare risultati preziosi di precedenti ricercatori, principalmente legati alla stimolazione dell’angiogenesi e dell’osteogenesi, oltre a offrire un nuovo “approccio raffinato” che potrebbe essere ulteriormente migliorato con il possibile uso di un composito PLA / bioglass (BG).
“Inoltre, il potenziale antimicrobico del bioglass dimostrato in vitro potrebbe essere utile”, hanno concluso i ricercatori. “L’efficacia di un concetto di scaffold adattato biologicamente, bioprintato e fisiologicamente migliorato per il supporto della guarigione dei difetti ossei può ora essere ulteriormente sviluppato e verificato in studi sperimentali.”
Rilevazione della deposizione di calcio mediante colorazione con alizarina su prototipo di impalcatura non colorato rivestito con cellule Saos-2 dopo 21 giorni: (a) l’impalcatura sinistra è stata seminata in mezzo RPMI; (b) l’impalcatura destra è stata incubata con terreno di differenziazione osteogenico; e (c) i risultati della PCR per la differenziazione osteogenica il giorno 21. Le cellule Saos-2 seminate su ponteggi sono state incubate con terreno RPMI e mezzo di differenziazione osteogenica. L’attenzione si è concentrata sul cDNA per le proteine osteogeniche: collagene 1 (Col1), fosfatasi alcalina (ALP) e osteocalcina (BGLAP). GAPDH è stato usato come standard interno. Vengono presentati i valori 2− (ΔΔCt).