L’ingegneria rigenerativa ossea potrebbe sostituire gli autoinnesti; tuttavia, nessun materiale sintetico soddisfa tutti i criteri di progettazione. I nanocarburi incorporati in matrici stampate tridimensionali (3DP) possono migliorare le proprietà, ma l’incorporazione è vincolata a una bassa percentuale in peso. Inoltre, i nanocarburi non modificati hanno un potenziale osteogenico limitato. La funzionalizzazione in grafene fosfato di calcio (CaPG) conferisce osteoinduttività e osteoconduttività, ma il carico nelle matrici è rimasto limitato. Questo lavoro presenta matrici 3DP-CaPG ad altissimo contenuto (90%). Le matrici 3DP-CaPG sono altamente porose (95%), moderatamente rigide (3 MPa) e meccanicamente robuste. In vitro, sono citocompatibili e inducono la differenziazione osteogenica delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC), indicate dalla fosfatasi alcalina, dalla mineralizzazione e dall’espressione di COL1α1. In vivo, la rigenerazione ossea è stata studiata utilizzando un modello di difetto calvario transgenico fluorescente-reporter murino. 3DP-CaPG stimola la crescita interna cellulare, trattiene le cellule del donatore e induce la differenziazione osteogenica. L’istologia mostra la colorazione TRAP attorno ai montanti, suggerendo una potenziale attività degli osteoclasti. È stato osservato un apparente riassorbimento di 3DP-CaPG che non ha presentato tossicità. 3DP-CaPG rappresenta un avanzamento verso una matrice sintetica di rigenerazione ossea.
introduzione
Le matrici in biomateriale osseo mirano a supportare la rigenerazione del tessuto osseo nel sito del difetto mentre si degrada e viene sostituito con osso di nuova generazione. I biomateriali ossei tradizionali sono stati sviluppati per sostituire il tessuto perso semplicemente riempiendo il difetto e stabilizzando la lesione; i materiali contemporanei mirano inoltre ad essere biologicamente attivi e rigenerare il tessuto osseo funzionale 1 . Nonostante i progressi verso questo obiettivo, non c’è ancora materiale per sostituire l’osso autogeno e possedere tutte le proprietà desiderabili tra cui osteoinduttività, sicurezza biologica, una lunga durata e costi di produzione ragionevoli 2 .
Sono stati applicati numerosi materiali per produrre una matrice sintetica che soddisfi questi criteri di progettazione 3 , 4 , 5 . Tra questi, i materiali grafenici hanno ricevuto notevole attenzione grazie alle eccellenti proprietà chimiche, meccaniche e biologiche, tra cui funzionalità regolabile, resistenza e compatibilità intrinseca. Questi materiali di carbonio nanostrutturati hanno una miriade di caratteristiche desiderabili che li rendono promettenti per l’uso in matrici sintetiche. Il grafene incontaminato è composto da atomi di carbonio ibridati sp 2 con elettroni π delocalizzati. Questa struttura chimicamente resiliente è eccezionalmente forte 6 e ha un’ampia superficie specifica 7utile per rinforzare fisicamente le matrici. Condizioni di forte reazione di ossidazione possono convertire alcuni atomi di carbonio ibridati sp 2 in ibridazione sp 3 . Questa forma ossidata, nota come ossido di grafene (GO), possiede maniglie chimiche dell’ossigeno per la processabilità e la funzionalizzazione 8 , 9 . Inoltre, le interruzioni del legame π–π del grafene incontaminato aumentano notevolmente la suscettibilità della spina dorsale ossidata a ulteriori reazioni chimiche. Pertanto, GO è degradabile attraverso condizioni biologicamente rilevanti e segue sia una via di degradazione acquosa 10 , 11 che una via di biodegradazione enzimatica e ossidativa 12 , 13 , 14, 15 , 16 , 17 , 18 , consentendo l’applicazione come matrice degradabile. Da un punto di vista biologico, i substrati grafenici possono promuovere l’adesione e la crescita delle cellule, con ulteriori prove che suggeriscono il loro potenziale osteogenico 19 , 20 . Per questo motivo, i materiali grafenici applicati come biomateriali si sono espansi rapidamente, soprattutto per l’ingegneria rigenerativa ossea 21 , 22 , 23 .
In precedenza abbiamo segnalato la creazione di una famiglia intrinsecamente osteoinduttiva di materiali grafenici funzionali chiamati grafeni fosfato (PG) con potenziale per la rigenerazione ossea 24 , 25 , 26 . I PG vengono preparati attraverso una modifica sintetica di GO in cui i polifosfati sono installati in modo covalente su GO e bilanciati con una varietà di controioni (ad es. Ca 2+ , K + , Li + , Mg 2+ o Na +). Attraverso il controllo dell’identità dei controioni e dell’agilità del metodo sintetico, possiamo prontamente mettere a punto le proprietà dei PG, inclusa la loro chimica superficiale, degradabilità, proprietà meccaniche, bioattività e osteoinduttività. Il calcio PG (CaPG) che imita i minerali ossei eluisce gli induttori Ca 2+ e PO 4 3− che fungono da molecole di segnalazione per indurre l’osteogenesi 27 , 28 . Abbiamo dimostrato che il CaPG è intrinsecamente osteoinduttivo, guida la differenziazione delle cellule staminali in cellule ossee e, quando combinato con le cellule stromali del midollo osseo (BMSC), induce un’osteogenesi de novo ectopicamente nello spazio sottocutaneo dei topi 24. È importante sottolineare che il CaPG è degradabile in prodotti citocompatibili attraverso entrambi i principali percorsi di degradazione in vivo: idrolitico ed enzimatico 25 . Mentre l’applicazione di CaPG in polvere nel nostro studio precedente può essere adatta per siti non portanti, una matrice CaPG meccanicamente robusta che fornisce gli stimoli meccanici e biochimici in modo spaziotemporale è necessaria per rendere questa tecnologia clinicamente praticabile.
La produzione additiva consente la generazione di strutture tridimensionali (3D) complesse e personalizzabili. Recentemente, i materiali grafenici sono stati incorporati nei processi di produzione additiva per migliorare le proprietà osteogeniche delle matrici risultanti per la rigenerazione ossea 29 , 30 . Tuttavia, i materiali grafenici non funzionalizzati mancano di osteoinduttività e l’inclusione di materiali grafenici nelle matrici stampate in 3D è in genere limitata a pochi 31 % in peso o al rivestimento non covalente della superficie dopo la fabbricazione. In letteratura, la maggior parte delle matrici non è studiata in vivo, sebbene alcuni articoli riportino risultati preclinici incoraggianti su animali 32 , 33 , 34 , 35 ,36 . Una panoramica di quest’area emergente è fornita in due revisioni contemporanee 29 , 30 .
Per ottenere una matrice intrinsecamente osteoinduttiva e personalizzabile composta principalmente da materiali grafenici funzionali, abbiamo sviluppato e studiato il potenziale osteogenico delle matrici CaPG (3DP-CaPG) stampate in 3D in vitro e in vivo. Abbiamo utilizzato i servizi di un metodo di stampa 3D disponibile in commercio per stampare costrutti porosi del nostro CaPG con una frazione di peso elevato (90% p/p). Questo metodo consente un contenuto di grafenico notevolmente elevato all’interno dell’inchiostro, consentendo prontamente l’accesso cellulare alla spina dorsale osteoconduttiva e il rilascio controllato di ioni calcio e fosfato dalla funzionalizzazione osteoinduttiva. Pertanto, la risposta dell’ospite alla matrice è dominata dal contenuto funzionale di grafenico e non dal legante bioinerte. Le nostre matrici mostrano efficacia osteogenica sia in vitro con cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) che in vivo in un modello di difetto osseo ortotopico. Le matrici CaPG osteomimetiche sono meccanicamente resilienti, biocompatibili, biodegradabili, osteoconduttive e osteoinduttive, potenzialmente sconvolgendo il paradigma della rigenerazione ossea.
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