SLAM utilizzato per fabbricare strutture complesse in idrogel con sfumature
Ci sono state molte ricerche sulla creazione di idrogel stampati in 3D e sul loro utilizzo per fabbricare tessuti funzionali . Gli idrogel di biopolimero, con proprietà che possono essere adattate e controllate, possono essere reticolati per replicare le strutture dei tessuti e viene spesso utilizzata la stampa 3D basata sull’estrusione. Ma l’uso di idrogel di biopolimeri come bioink per la stampa 3D è difficile, a causa di problemi come la bassa viscosità e problemi nel controllo delle variazioni della microstruttura. Alcuni ricercatori si sono rivolti ai metodi di stampa 3D incorporati, ma questo ha un suo elenco di problemi, come ad esempio avere difficoltà a estrarre il prodotto finale.
Le ricercatrici britanniche Jessica J. Senior, Megan E. Cooke, Liam M. Grover e Alan M. Smith dell’Università di Huddersfield e dell’Università di Birmingham hanno creato un metodo chiamato produzione additiva a strato sospeso, o SLAM, che può estrudere biopolimeri a bassa viscosità in una matrice fluido-gel autorigenerante. Il team ha recentemente pubblicato un articolo sul loro lavoro, intitolato ” Fabbricazione di strutture complesse in idrogel mediante produzione di additivi a strato sospeso (SLAM). ”Vale la pena notare qui che FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) è una tecnologia straordinariamente simile se non identica. Finora non ci stiamo impegnando a definire quale termine dovrebbe vincere qui, ma ci stiamo adoperando per usare FRESH perché renderà più semplice per tutti andare avanti.
Gli abstract affermano: “Ci sono stati diversi approcci recentemente segnalati per la produzione di idrogel complessi contenenti cellule stampati in 3D. Data la fragilità delle parti durante la produzione, gli approcci di maggior successo utilizzano un letto di gel in particelle di supporto e hanno consentito la produzione di strutture di gel complesse precedentemente irraggiungibili utilizzando altri metodi di stampa 3D. Il letto di gel di supporto protegge la fragile parte stampata durante il processo di stampa, impedendo alla struttura di collassare sotto il suo stesso peso prima della reticolazione. Nonostante l’apparente somiglianza dei letti di particolato, il modo in cui le particelle vengono fabbricate influenza fortemente il modo in cui interagiscono tra loro e la parte durante la fabbricazione, con implicazioni per la qualità del prodotto finale. Recentemente, è dimostrato che il processo di produzione additiva a strato sospeso (SLAM) crea una struttura che ricapitola la regione osteocondrale stampando in un gel di particolato di agarosio. Il processo di fabbricazione di questo gel (l’applicazione del taglio durante la gelificazione) ha prodotto un gel autorigenerante con rapido recupero delle sue proprietà elastiche a seguito di interruzioni. “
SLAM funziona così: il raffreddamento a taglio di una soluzione di agarosio caldo durante la transizione sol-gel crea il letto di stampa fluido-gel, poiché i gel fluidi si comportano come liquidi una volta applicato lo stress. Quindi, la soluzione viene inserita in un contenitore per supportare l’impalcatura. Idrogel e cellule vengono miscelati per produrre un bioink, che viene aggiunto a una cartuccia per bioprinter ed estruso nella matrice autorigenerante a fluido-gel. Il bioink viene quindi sospeso nel suo stato liquido e la solidificazione viene indotta attraverso la reticolazione e i media cellulari, che forniscono anche metabolita ai ponteggi cellulari. Il costrutto viene rilasciato dal gel di supporto attraverso un lavaggio a basso taglio con acqua deionizzata.
Il metodo impedisce l’avvio della gelazione durante la stampa 3D, che consente una grande integrazione dello strato e “la produzione di costrutti da due o più materiali diversi che hanno proprietà fisico-chimiche e meccaniche diverse”, che crea una parte con comportamento anisotropico.
“Per dimostrare l’applicazione clinica, abbiamo recentemente creato una struttura che ha ricapitolato la regione osteocondrale (la cui microstruttura cambia attraverso un’interfaccia dei tessuti duri / molli) come diretta dalla tomografia a microcomputer (micro-CT) per fornire dimensioni precise ed è stata adattata per supportare fenotipi cellulari specifici controllando il microambiente “, hanno spiegato i ricercatori. “Questi complessi scaffold presentano gradienti meccanici simili a quelli riscontrati nell’ECM e svolgono un ruolo cruciale nella prevenzione dei guasti meccanici tra i tessuti di interconnessione e nel mantenimento del fenotipo cellulare”.
I ricercatori dovevano considerare le proprietà meccaniche del piano di stampa fluido-gel durante la stampa SLAM 3D, in quanto “possono influire sulla risoluzione e sulla complessità del costrutto”.
“Un’altra tecnica di stampa incorporata, l’incorporamento reversibile a forma libera di idrogel sospesi (FRESH), sviluppato da Hinton et al., Utilizza un bagno di supporto ai residui di gelatina, tuttavia il comportamento reologico di tale materiale come agente di sospensione per la bioprinting 3D non è stato studiato a fondo “, Hanno scritto i ricercatori.
Inoltre, hanno preparato gel fluidi a diverse concentrazioni di agarosio al fine di trovare la migliore formulazione per la stampa 3D di particelle di dimensioni uniformi, e hanno studiato gli aghi con diametri interni diversi e una soluzione di colorazione a bassa viscosità, per trovare la risoluzione di stampa ottimale.
“All’aumentare del diametro interno dell’ago, la potenziale risoluzione diminuiva. Inoltre, con aghi più grandi, lo spessore del filamento stampabile era più variabile. Ciò è probabilmente dovuto all’estrusione di più materiale e alla maggiore deformazione del letto di stampa fluido-gel. Nelle soluzioni a bassa viscosità a basso Mw (peso molecolare), la diffusione è anche un fattore limitante per la risoluzione “, hanno spiegato i ricercatori.
Sono stati usati bioink di alginato, collagene, gomma di gellano e i -cararrageenan per dimostrare quante strutture complesse potrebbero essere realizzate. Un’intricata struttura reticolare ha mostrato la scala e la complessità che SLAM può raggiungere, mentre è stato prodotto un disco intervertebrale T7 per mostrare come il sistema è in grado di stampare grandi strutture di massa e un ragno è stato un esempio di stampa 3D di parti più piccole e più complesse.
Diverse strutture cave e biforcanti, come un modello di arteria carotidea e una struttura tubolare a pareti spesse, sono state stampate per mostrare come il sistema può creare geometrie impossibili senza un collettore 2D.
“Queste strutture evidenziano la capacità di questa tecnica per la fabbricazione a mano libera in quanto le grandi strutture a sbalzo possono essere stampate senza la necessità di ulteriori strutture di supporto”, hanno spiegato i ricercatori.
Il metodo SLAM può anche depositare più strati lateralmente, orizzontalmente e all’interno di “un estruso precedentemente depositato”, che consente di fabbricare i costrutti con gli stessi gradienti biochimici e meccanici che si possono trovare nei tessuti nativi. La tecnica utilizza anche la microestrusione per erogare continuamente bioink, che ha causato una migliore precisione di erogazione rispetto all’uso della stampa a getto d’inchiostro e consente una maggiore libertà con le densità delle cellule all’interno del bioink.
“Precedenti studi hanno indicato che l’uso di stampanti a getto d’inchiostro consente una riduzione delle sollecitazioni di taglio indotte dalla stampa applicate alle popolazioni di cellule sospese rispetto ai metodi di microestrusione, tuttavia, ci sono caratteristiche chiave del letto di supporto utilizzato per SLAM che consente la minimizzazione del taglio mediante microestrusione, “Hanno scritto i ricercatori.
Grazie al letto fluido-gel di supporto di SLAM, è possibile utilizzare bioink a bassa viscosità: la viscosità del materiale può causare induzione a taglio nei bioink, quindi è ottimale per la fabbricazione di idrogel.
“Utilizzando il nostro sistema, è stato quindi dimostrato che i problemi associati al taglio cellulare durante la microestrusione possono essere facilmente ridotti, ottenendo sforzi di taglio ammirevolmente bassi sulle cellule che competono con quelli osservati durante altre forme di biofabbricazione, comprese le tecniche drop-on-demand come il getto d’inchiostro stampa “, ha scritto il team.
Il metodo SLAM può anche incorporare più idrogel di biopolimeri in un’unica struttura, che è importante per “soddisfare le variazioni meccaniche, chimiche e biologiche che si verificano in tutto il tessuto nativo”. I ricercatori hanno dimostrato questa capacità stampando in 3D un costrutto osteocondrale, con ex vivo condrociti depositati in uno strato di gomma gellan e osteoblasti in uno di gellan-idrossiapatite. Ma sono andati ancora oltre e hanno utilizzato SLAM per stampare in 3D strutture integrate con diversi prodotti chimici e meccanismi di gelatina.
“I biopolimeri ionotropicamente gelificati (alginato, gellano e ι-carrageenan) e termicamente gelificati (collagene) sono stati integrati con successo per formare interfacce interfase bifase”, hanno scritto i ricercatori.
I materiali si sono mescolati abbastanza da non causare guasti meccanici, un ambiente che imita da vicino l’ambiente dei tessuti nativi.
“Inoltre, questa tecnica di stampa di strutture stratificate integrate non è solo conforme alla stampa di diversi materiali strato su strato, ma anche alla deposizione di un secondo materiale al centro di un altro. Ad esempio, oltre a produrre costrutti a strati, è stato possibile creare strutture core-shell stampate in 3D comprendenti un nucleo cilindrico di collagene incapsulato all’interno di un cilindro gellan o alginato con varie dimensioni “, hanno continuato.
“Un altro vantaggio di poter depositare con precisione il materiale dell’impalcatura è che il comportamento cellulare può essere manipolato spazialmente. Polimeri come collageni saturi di domini di legame con integrina consentono l’attaccamento cellulare allo scaffold, mentre l’alginato e il gellan non possiedono naturalmente motivi di attaccamento cellulare e invece incapsulano cellule con un attaccamento minimo al materiale circostante. “
Per saperne di più sull’uso del team di SLAM per la stampa 3D di impalcature a gradiente multistrato, ti suggerisco di leggere il documento: possono spiegarlo molto meglio.
“In sintesi, abbiamo dimostrato che la tecnica SLAM può essere utilizzata per superare i problemi associati all’uso di bioink a bassa viscosità nella bioprinting basata sull’estrusione”, hanno concluso i ricercatori. “Il metodo ha consentito la fabbricazione di successo di idrogel sfusi, intricati, bifasici e incapsulati in fase da una varietà di materiali biopolimero che sono attualmente ampiamente studiati nella medicina rigenerativa. Inoltre, è stato dimostrato che gradienti spaziali controllati nelle proprietà meccaniche e chimiche possono essere prodotti in una singola parte con integrità dell’interfaccia tra materiali diversi. Ciò consente di progettare le proprietà fisico-chimiche della struttura di conseguenza con la capacità di controllare la porosità, i gradienti meccanici, la distribuzione cellulare e la morfologia. “
Ottimizzazione dei parametri di stampa all’interno del gel fluido di agarosio. A – G) Risoluzione del bioink stampato all’interno del supporto del letto fluido usando più diametri di ago e H – J) diffusione del colorante attraverso il gel in determinati punti temporali. 
A) Reticolo intricato prima (a sinistra) e dopo l’estrazione (a destra) dal letto. B) Disco intervertebrale T7 come file CAD (a sinistra) e laterale (al centro) e apicale (a destra). C) Intricata struttura di massa sotto forma di un ragno gellano. D) Carotide come file CAD (a sinistra) e durante la stampa (a destra). D) Struttura tubolare (a sinistra) che dimostra la durabilità del materiale (al centro) e la perfusibilità. 
A, B) Impalcature a doppio strato che utilizzano combinazioni di collagene-alginato e collagene-gellano. C) Impalcatura di gellan-guscio di collagene-core grande e D) Impalcatura di gusci-guscio di collagene-core di piccole dimensioni E) Schema del diagramma che mostra il controllo del comportamento cellulare con motivi di attaccamento che portano complessi nel gel di collagene superiore e nessun motivo di attaccamento per la sospensione cellulare all’interno di un gel di alginato. F) Micro-CT che mostra la porosità del gradiente all’interno di un’impalcatura liofilizzata di collagene-alginato. G) Micrografie confocali di colorazione delle cellule Hoechst / actina di HDF attaccate nello strato di collagene e sospese nelle regioni di alginato di un ponteggio a doppio strato. H) Sforzo contro Gʹ che mostra variazioni nella forza e nell’elasticità del gel attraverso un’impalcatura di collagene-alginato. 