Un gruppo di ricercatori del Birla Institute of Technology and Science – BITS Pilani, K.K. Birla Goa Campus, in India, ha sviluppato un idrogel basato su polimeri di grado farmaceutico che può essere lavorato attraverso stampa 3D a estrusione semisolida e utilizzato come piattaforma sia per la realizzazione di scaffold destinati alla ricerca sulla rigenerazione della pelle sia per la produzione di forme farmaceutiche personalizzate.
Il lavoro, pubblicato sul Journal of Biological Engineering, è stato condotto da Hemant Kumar Bankhede, Maheswari Sivaravi, Antara Poi Raiturker, Prajakta Praveen Bhende, Sagar B. Kale, Mamta Keshav Tari, Asima Shaukat e Anasuya Ganguly, appartenenti ai dipartimenti di Biological Sciences e Chemical Engineering del BITS Pilani Goa Campus.
La ricerca è stata coordinata da Anasuya Ganguly, principal investigator dei programmi che hanno finanziato il lavoro.
L’aspetto più interessante non consiste soltanto nella possibilità di stampare un nuovo idrogel. I ricercatori hanno cercato di costruire una piattaforma utilizzando materiali già ampiamente conosciuti dall’industria farmaceutica, con caratteristiche di qualità e sicurezza maggiormente standardizzate rispetto a numerosi bioink sperimentali.
La formulazione combina Starch 1500, maltodestrina e alginato di sodio, tre sostanze con ruoli differenti nella miscela e con una lunga storia di utilizzo in formulazioni farmaceutiche o alimentari.
Lo stesso sistema è stato successivamente adattato per incorporare glimepiride, farmaco utilizzato nel trattamento del diabete di tipo 2, e produrre mediante stampa 3D compresse masticabili da 2 mg caratterizzate da un rilascio prolungato nell’arco di quattro ore.
Un idrogel costruito con materiali già utilizzati dall’industria farmaceutica
Uno dei problemi nella ricerca sui bioink riguarda la scelta dei materiali.
Molte formulazioni destinate al bioprinting utilizzano proteine, derivati biologici o polimeri specializzati che possono essere costosi, presentare variazioni tra differenti lotti oppure introdurre ulteriori difficoltà quando si deve passare dalla ricerca di laboratorio a un’applicazione regolamentata.
Il gruppo del BITS Pilani ha adottato un approccio differente.
Gli scienziati hanno cercato componenti già utilizzati nella produzione farmaceutica, disponibili in qualità controllata e con proprietà sufficientemente documentate.
La formulazione comprende innanzitutto Starch 1500, un amido di mais parzialmente pregelatinizzato prodotto da Colorcon.
Il materiale è utilizzato nell’industria farmaceutica come eccipiente multifunzionale e può assorbire acqua anche a temperatura relativamente bassa. Nell’idrogel contribuisce ad aumentare la viscosità e a ottenere una consistenza adatta all’estrusione.
Il secondo componente è Glucidex 12D, una maltodestrina fornita da Roquette.
La maltodestrina viene normalmente impiegata in numerose formulazioni alimentari e farmaceutiche. Nel materiale sviluppato dal BITS Pilani contribuisce alle caratteristiche di flusso, alla risposta meccanica e al controllo dell’osmolarità.
Il terzo elemento è l’alginato di sodio, utilizzato come agente gelificante e proveniente, nella sperimentazione descritta dai ricercatori, da DuPont Nutrition.
L’alginato possiede una caratteristica particolarmente utile per il bioprinting: può formare rapidamente una struttura reticolata quando entra in contatto con ioni calcio.
Il cloruro di calcio trasforma la miscela in un gel stampabile
La formazione dell’idrogel viene ottenuta attraverso una reticolazione ionica.
Alla miscela contenente amido, maltodestrina e alginato viene aggiunta una soluzione di cloruro di calcio.
Gli ioni calcio interagiscono con le catene dell’alginato, creando collegamenti che trasformano progressivamente la miscela in una struttura semisolida.
Questo meccanismo permette di ottenere un materiale sufficientemente morbido da attraversare l’ugello della biostampante ma abbastanza stabile da mantenere la forma dopo la deposizione.
È uno dei principali problemi nella stampa 3D degli idrogel.
Se il materiale è troppo fluido, può essere estruso facilmente ma tende a collassare appena viene depositato.
Se è troppo viscoso, mantiene bene la geometria ma può richiedere pressioni elevate, intasare l’ugello oppure sottoporre eventuali cellule incorporate a sollecitazioni eccessive.
La formulazione sviluppata dal BITS Pilani cerca quindi un compromesso tra estrudibilità e stabilità geometrica.
Shear thinning: il materiale diventa più fluido quando viene spinto nell’ugello
I test reologici hanno evidenziato una caratteristica molto importante per la stampa 3D a estrusione: il comportamento shear-thinning.
Significa che la viscosità del materiale diminuisce quando aumenta la sollecitazione di taglio.
Durante la stampa, la pressione esercitata all’interno della siringa e dell’ugello rende quindi l’idrogel temporaneamente più fluido, facilitandone l’uscita.
Una volta depositato e cessata la sollecitazione, il materiale recupera una parte consistente della viscosità originale.
Il gruppo del BITS Pilani ha misurato un recupero tissotropico dell’87%.
È una proprietà particolarmente importante perché permette al filamento estruso di non trasformarsi immediatamente in una massa informe.
La viscosità misurata è stata di circa 1,56 × 10⁶ mPa·s, valore compatibile con la stampa semisolida utilizzata nello studio.
Il materiale ha mostrato uno yield stress di circa 20 Pa e un flow point di circa 108 Pa, parametri utilizzati per descrivere il passaggio dal comportamento prevalentemente solido a quello necessario per il flusso.
Griglie e spirali per verificare la precisione di stampa
Per verificare la stampabilità, il gruppo ha prodotto diverse geometrie.
Sono state realizzate strutture quadrate a griglia da 10 × 10 mm, geometrie a spirale e scaffold multilayer da 30 × 30 mm costituiti da cinque strati.
Le prove hanno mostrato una deposizione relativamente uniforme del materiale.
Il diametro medio dei filamenti è risultato pari a circa 0,90 ± 0,06 mm.
Particolarmente interessante è risultata anche la forma dei pori.
Una struttura progettata con aperture quadrate tende a deformarsi se il materiale è troppo fluido: gli angoli si arrotondano e le aperture possono progressivamente chiudersi.
Nel materiale sviluppato dai ricercatori, la geometria dei pori è rimasta molto vicina al quadrato ideale.
Questo indica che l’idrogel riesce a conservare la forma definita dal percorso della stampante dopo l’estrusione.
La porosità è fondamentale per uno scaffold cutaneo
Produrre una geometria corretta è però soltanto il primo requisito per un possibile scaffold destinato al tissue engineering.
Una struttura progettata per sostenere la crescita cellulare deve essere porosa.
I pori possono permettere il trasferimento di nutrienti, l’eliminazione dei prodotti metabolici e la progressiva colonizzazione della struttura da parte delle cellule.
Dopo la liofilizzazione, i ricercatori hanno analizzato la microstruttura degli scaffold anche mediante microscopia elettronica.
La porosità media è risultata pari a circa 62,7%, mentre la dimensione media dei pori era di circa 39,2 micrometri, con una variabilità di ±13,8 micrometri.
La porosità si colloca all’interno dell’intervallo generalmente considerato interessante per diverse applicazioni legate alla riparazione delle ferite, anche se il valore ottimale dipende fortemente dal tipo di tessuto, dalle cellule utilizzate e dalla funzione richiesta allo scaffold.
Lo scaffold assorbe acqua e poi si degrada
Un materiale destinato alla rigenerazione tissutale non deve necessariamente rimanere permanentemente nel corpo.
In molte applicazioni l’obiettivo è creare una struttura temporanea.
Lo scaffold sostiene inizialmente la crescita delle cellule e viene poi progressivamente degradato mentre il nuovo tessuto prende il suo posto.
Per questo i ricercatori hanno studiato anche il comportamento dell’idrogel nel tempo.
Gli scaffold hanno assorbito acqua fino a raggiungere un aumento equivalente a circa il 72% del proprio peso entro 24 ore.
La capacità di assorbire liquido è importante nelle applicazioni cutanee perché l’ambiente di una ferita contiene fluidi e deve essere mantenuto in condizioni compatibili con il processo di guarigione.
La degradazione significativa è iniziata dopo circa due settimane.
Entro il 35° giorno, gli scaffold avevano perso approssimativamente l’82% della loro massa.
È un comportamento coerente con l’idea di una struttura temporanea destinata a fornire supporto nelle prime fasi della riparazione e successivamente scomparire.
La resistenza è interessante, ma l’elasticità rimane un limite
Il gruppo ha esaminato anche le proprietà meccaniche del materiale.
Film ottenuti dalla stessa formulazione hanno mostrato una resistenza a trazione di circa 33,9 MPa, valore che rientra nell’ampio intervallo riportato per la pelle umana.
Il dato non deve però essere interpretato come dimostrazione che lo scaffold si comporti già come vera pelle.
Esiste infatti una differenza importante.
L’allungamento a rottura è risultato soltanto del 4,5% circa.
La pelle umana può invece sostenere deformazioni molto superiori e gli scaffold destinati alla sostituzione o al supporto di tessuti cutanei vengono spesso progettati per raggiungere valori di allungamento compresi tra decine e oltre cento per cento.
Il materiale del BITS Pilani è quindi relativamente resistente ma poco elastico.
Gli stessi autori riconoscono questa limitazione e suggeriscono che, nella configurazione attuale, potrebbe risultare più adatto a zone del corpo sottoposte a movimenti limitati.
Esiste inoltre un’altra cautela metodologica importante: i test a trazione sono stati effettuati su film colati e non direttamente sugli scaffold stampati in 3D.
La struttura a griglia può comportarsi meccanicamente in modo molto diverso rispetto a un film continuo.
Fibroblasti e cheratinociti per verificare la compatibilità cellulare
Per una possibile applicazione cutanea è necessario verificare che il materiale non risulti tossico per le cellule.
Il gruppo del BITS Pilani ha quindi utilizzato due tipi cellulari.
I primi sono fibroblasti murini L929, una linea cellulare comunemente utilizzata negli studi di citotossicità e biocompatibilità.
I secondi sono cheratinociti umani HaCaT, importanti perché i cheratinociti rappresentano le principali cellule dell’epidermide.
La vitalità dei fibroblasti L929 è risultata compresa indicativamente tra il 75 e il 90%.
Il comportamento delle cellule HaCaT è stato inizialmente meno favorevole.
Dopo 24 ore, la vitalità misurata era compresa approssimativamente tra il 55 e il 66%.
Dopo 48 ore è però salita oltre l’80%.
Le immagini microscopiche hanno mostrato l’adesione e la crescita delle cellule sulla superficie del materiale, con una risposta particolarmente positiva dei fibroblasti.
I risultati indicano una compatibilità promettente, ma non equivalgono ancora alla dimostrazione che lo scaffold possa rigenerare una ferita reale.
Anche il contatto con il sangue è stato valutato
I ricercatori hanno condotto inoltre test di emocompatibilità utilizzando sangue di volontari sani, dopo l’approvazione del comitato etico del BITS Pilani.
L’emolisi misurata è stata pari a circa 5%.
Il risultato colloca il materiale nella categoria considerata emocompatibile secondo i criteri utilizzati nello studio.
La verifica è importante perché uno scaffold applicato a una ferita potrebbe entrare in contatto con sangue e fluidi biologici.
Il lavoro, tuttavia, non comprendeva esperimenti su animali.
Lo studio deve quindi essere interpretato come una caratterizzazione in vitro del materiale e non come dimostrazione di efficacia terapeutica.
Lo stesso idrogel viene trasformato in una piattaforma farmaceutica
La seconda parte dello studio prende una direzione differente.
I ricercatori hanno utilizzato la stessa base polimerica per creare un materiale destinato alla stampa 3D di farmaci.
Alla formulazione sono stati aggiunti 2 mg di glimepiride, un principio attivo utilizzato nel trattamento del diabete mellito di tipo 2.
Sono stati aggiunti anche aspartame come dolcificante e Ponceau 4R aluminum lake come colorante, ottenendo una miscela adatta alla realizzazione di compresse masticabili.
Il concetto alla base della ricerca è la possibilità di modificare digitalmente forma, dimensione e quantità di materiale depositato per produrre dosaggi più facilmente personalizzabili rispetto alle compresse convenzionali.
La stampa è stata effettuata utilizzando una Bioform bioprinter prodotta dalla società indiana Sytolab, dotata di una siringa Luer-Lock da 10 ml.
Le geometrie sono state preparate tramite CAD e successivamente elaborate con il software SuperSlicer.
Stampare a temperatura ambiente protegge i farmaci sensibili al calore
Una delle caratteristiche interessanti della tecnologia utilizzata dal BITS Pilani è la stampa a temperatura ambiente.
Alcune tecniche di stampa 3D farmaceutica utilizzano processi termici nei quali il materiale deve essere riscaldato e fuso.
Questi sistemi possono risultare poco adatti a principi attivi che si degradano alle alte temperature.
L’estrusione semisolida evita questo problema.
Il materiale viene spinto attraverso una siringa e mantiene la propria forma grazie alle caratteristiche reologiche dell’idrogel e alla reticolazione.
Questo potrebbe ampliare il numero di farmaci compatibili con il processo, anche se ogni principio attivo dovrebbe naturalmente essere studiato individualmente.
Compresse da un grammo prima della liofilizzazione
Durante la stampa, ogni compressa aveva inizialmente una massa di circa 1.000 mg.
I campioni sono stati poi congelati a -80 °C e successivamente sottoposti a liofilizzazione.
La liofilizzazione elimina una grande quantità di acqua attraverso sublimazione, lasciando una struttura molto più leggera.
Al termine del processo, le compresse pesavano mediamente circa 150 mg.
Per questa fase sono state utilizzate apparecchiature di Esco per il congelamento e un sistema di liofilizzazione Labconco.
Le compresse sono state successivamente sottoposte a verifiche di peso, dimensioni, durezza, contenuto del farmaco e dissoluzione.
Il problema dei farmaci a basso dosaggio
La glimepiride è interessante come caso di studio anche perché viene somministrata in quantità molto piccole.
La formulazione testata conteneva soltanto 2 mg di principio attivo.
Produrre farmaci a basso dosaggio richiede un controllo particolarmente accurato dell’uniformità.
Se un principio attivo rappresenta una percentuale molto piccola della massa totale della compressa, una distribuzione non uniforme della polvere può provocare differenze significative tra una dose e l’altra.
Nella produzione tradizionale vengono utilizzati processi specifici, come la granulazione, proprio per migliorare l’omogeneità.
Nel sistema sviluppato dal BITS Pilani, l’elevata viscosità della miscela sembra aver contribuito a mantenere le particelle di glimepiride sospese durante la stampa, riducendo la sedimentazione.
Contenuto medio del 100,4%
Cinque compresse sono state analizzate mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni utilizzando una piattaforma Agilent 1260.
Il contenuto medio del farmaco è risultato pari al 100,4% del valore nominale, con una deviazione standard del 2,8%.
Il dato suggerisce una buona uniformità tra i campioni prodotti.
Per un farmaco a basso dosaggio è un risultato particolarmente importante.
La personalizzazione della dose non avrebbe infatti alcun valore clinico se il processo di stampa non fosse in grado di garantire che la quantità effettivamente contenuta nella compressa corrisponda a quella prevista dal file digitale.
Rilascio della glimepiride distribuito su quattro ore
Il comportamento delle compresse è stato analizzato anche attraverso prove di dissoluzione.
I ricercatori hanno utilizzato una metodologia basata sulle indicazioni della United States Pharmacopeia, con soluzione tampone a pH 7,8 mantenuta a 37 °C.
I campioni sono stati analizzati in diversi momenti, da 15 minuti fino a quattro ore.
La glimepiride è stata rilasciata progressivamente nel corso delle quattro ore di prova.
Il comportamento sembra derivare in parte dalla bassa solubilità in acqua del principio attivo e in parte dalla sua incorporazione nella matrice reticolata dell’idrogel, che rallenta la diffusione verso l’esterno.
Gli autori interpretano quindi il sistema come una possibile piattaforma per il rilascio prolungato.
Esiste però un limite importante.
Lo studio non ha confrontato direttamente la curva di rilascio con quella di un prodotto farmaceutico commerciale né ha utilizzato una specifica farmacopoeica come criterio di equivalenza.
I risultati dimostrano quindi il comportamento del prototipo, non la sua equivalenza terapeutica con una compressa approvata.
Perché stampare un farmaco invece di produrlo normalmente
Per farmaci prodotti in milioni di compresse identiche, le tradizionali linee di compressione rimangono estremamente efficienti.
Il possibile vantaggio della stampa 3D emerge quando la dose deve cambiare da paziente a paziente.
Un medico potrebbe teoricamente prescrivere una quantità specifica e il sistema digitale potrebbe modificare volume, geometria o concentrazione della compressa.
La stessa tecnologia potrebbe permettere di modificare la velocità di rilascio attraverso variazioni della geometria interna.
L’obiettivo non è quindi necessariamente sostituire le linee farmaceutiche convenzionali.
È creare un sistema complementare per quelle situazioni nelle quali la personalizzazione ha un valore clinico sufficiente da giustificare una produzione in quantità molto limitate.
Bambini, anziani e pazienti con difficoltà di deglutizione
La possibilità di produrre compresse masticabili introduce anche un secondo elemento.
Molti pazienti hanno difficoltà a deglutire compresse convenzionali.
Il problema riguarda in particolare bambini e anziani, ma può verificarsi in numerose condizioni cliniche.
La formulazione del BITS Pilani comprende un dolcificante e un colorante proprio per ottenere una forma farmaceutica potenzialmente più facilmente accettabile dal paziente.
Con la stampa 3D sarebbe inoltre possibile intervenire su dimensioni e geometria del prodotto.
In prospettiva si potrebbero quindi personalizzare non soltanto la quantità di principio attivo, ma anche caratteristiche fisiche della dose.
Una sola piattaforma per due settori apparentemente lontani
L’aspetto forse più originale dello studio è proprio la capacità della stessa formulazione di base di essere utilizzata in due campi differenti.
Nel tissue engineering l’idrogel viene trasformato in una struttura porosa che deve sostenere cellule, assorbire liquidi e degradarsi progressivamente.
Nel drug delivery lo stesso sistema diventa una matrice all’interno della quale un principio attivo viene distribuito e rilasciato nel tempo.
In entrambi i casi è essenziale il controllo della viscosità.
Nel primo caso determina la fedeltà geometrica dello scaffold.
Nel secondo contribuisce alla distribuzione uniforme del farmaco e alla qualità della compressa.
La piattaforma dimostra quindi come le competenze sviluppate per il bioprinting possano sovrapporsi a quelle della produzione farmaceutica personalizzata.
Materiali animal-free per ridurre variabilità e complessità
Un’altra caratteristica sottolineata dal gruppo di ricerca è l’assenza di componenti di origine animale nella formulazione di base.
Numerosi bioink sperimentali utilizzano collagene, gelatina o altre sostanze derivate da tessuti biologici.
Questi materiali possono offrire ottime caratteristiche per l’interazione cellulare, ma presentano anche potenziali problemi legati alla variabilità biologica, alla tracciabilità e alla standardizzazione.
Starch 1500 di Colorcon, maltodestrina Glucidex di Roquette e alginato impiegato nello studio sono invece materiali prodotti secondo specifiche industriali ben definite.
Questo non significa che la loro approvazione come eccipienti renda automaticamente approvato anche il nuovo idrogel.
Una nuova combinazione destinata a un dispositivo medico, a uno scaffold o a un farmaco deve comunque affrontare tutte le verifiche regolatorie previste per l’applicazione finale.
La disponibilità di una storia d’uso documentata dei singoli ingredienti può però ridurre alcune delle incognite iniziali.
Il percorso verso la clinica resta ancora lungo
I risultati ottenuti dal BITS Pilani sono promettenti, ma il lavoro si trova ancora in una fase di ricerca.
Per l’applicazione cutanea saranno necessari ulteriori studi sulle proprietà meccaniche degli scaffold realmente stampati, sulla loro elasticità, sulla risposta a lungo termine delle cellule e sul comportamento in modelli biologici più complessi.
Dovrà inoltre essere studiata la sterilizzazione del materiale.
Uno scaffold destinato a entrare in contatto con una ferita deve essere sterile e il processo utilizzato per sterilizzarlo non deve modificarne in modo significativo geometria, struttura chimica o comportamento meccanico.
Per l’applicazione farmaceutica dovranno essere affrontati altri problemi: stabilità del principio attivo, riproducibilità su lotti più grandi, conservazione, confezionamento, durata nel tempo e confronto con prodotti di riferimento.
La stessa procedura di liofilizzazione, che nello studio richiede un congelamento e un successivo ciclo di drying, dovrà essere valutata dal punto di vista dei costi e della produttività se il metodo verrà portato oltre il laboratorio.
La ricerca è sostenuta da programmi indiani dedicati alle biotecnologie
Il progetto è stato supportato dal programma Blockchain for Impact – BFI-BIOME, attraverso il progetto “Pharmaceutical Polymer-based Bioink for Skin Tissue Constructs”.
Una parte del lavoro dedicato alla formulazione farmaceutica è stata inoltre finanziata attraverso il Cross Department Research Funding del BITS Pilani.
Il programma ha ricevuto anche sostegno dal progetto DBT BUILDER, promosso dal Department of Biotechnology indiano per lo sviluppo della ricerca interdisciplinare nelle scienze della vita.
La presenza di finanziamenti provenienti sia dall’ambito biomedicale sia da quello farmaceutico riflette la doppia natura della piattaforma sviluppata dal gruppo.
La stampa 3D non serve solo a creare la forma
Il lavoro del BITS Pilani evidenzia un passaggio importante nell’evoluzione della stampa 3D biomedicale.
Nelle prime applicazioni l’attenzione era concentrata soprattutto sulla possibilità di riprodurre forme anatomiche complesse.
Con gli idrogel, il problema diventa molto più articolato.
La geometria costituisce soltanto una parte della funzione.
Il materiale deve cambiare viscosità mentre attraversa l’ugello, recuperare stabilità dopo la deposizione, mantenere una struttura porosa, assorbire liquidi, degradarsi secondo tempi compatibili con l’applicazione e consentire alle cellule di sopravvivere.
Quando viene utilizzato per un farmaco, deve contemporaneamente garantire che il principio attivo sia distribuito uniformemente e venga rilasciato secondo un profilo controllato.
La stampa diventa quindi uno strumento per organizzare materiale, struttura e funzione nello stesso processo.
Un possibile ponte tra bioprinting e farmacia personalizzata
La ricerca del BITS Pilani K.K. Birla Goa Campus non dimostra ancora che lo stesso idrogel possa essere utilizzato domani in ospedale per guarire una ferita o produrre direttamente una terapia individuale.
Dimostra però che una formulazione relativamente semplice, costruita con tre polimeri già utilizzati dall’industria farmaceutica, può soddisfare una serie sorprendentemente ampia di requisiti.
Il materiale è stampabile a temperatura ambiente, mantiene geometrie multistrato, possiede una struttura porosa, assorbe acqua, si degrada progressivamente, supporta la crescita di fibroblasti e cheratinociti e mostra un comportamento compatibile con il sangue nei test effettuati.
La stessa matrice può inoltre incorporare una dose molto bassa di glimepiride, essere trasformata in compresse masticabili e ottenere un contenuto medio pari al 100,4% del valore previsto, con rilascio del farmaco distribuito nell’arco di quattro ore.
Rimangono limiti importanti, a partire dalla ridotta elasticità dello scaffold e dalla necessità di ulteriori verifiche biologiche e regolatorie.
Proprio per questo il valore del lavoro non deve essere ricercato nell’annuncio di un prodotto pronto per l’uso clinico.
Il risultato più significativo è la dimostrazione di una piattaforma di materiali farmaceutici stampabili che potrebbe essere adattata a funzioni differenti semplicemente modificando geometria, formulazione e contenuto.
È una direzione nella quale bioprinting, tissue engineering e produzione farmaceutica personalizzata iniziano a convergere: la stampante non produce più soltanto un oggetto con una forma specifica, ma può diventare uno strumento per controllare contemporaneamente architettura, comportamento biologico e modalità di rilascio di una sostanza terapeutica.
Questo articolo è stato redatto con il supporto di strumenti di intelligenza artificiale (AI)
