Una rete vascolare stampata alla scala dei capillari
Un gruppo di ricercatori della University of Notre Dame ha sviluppato un sistema ibrido di bioprinting capace di realizzare microcanali vascolari con dimensioni inferiori a 10 micrometri, arrivando in alcune prove a una larghezza di circa 5,6 micrometri.
Si tratta di dimensioni inferiori a quelle di un comune capello umano e compatibili con la scala dei più piccoli vasi presenti nell’organismo.
La ricerca affronta uno dei problemi più complessi della biofabbricazione: realizzare all’interno di un tessuto artificiale una rete vascolare sufficientemente fitta, gerarchica e controllabile da avvicinarsi all’organizzazione dei vasi sanguigni naturali.
Il lavoro è stato coordinato da Yanliang Zhang, docente presso il Department of Aerospace and Mechanical Engineering della University of Notre Dame, insieme a Yu Shrike Zhang della Harvard Medical School e del Brigham and Women’s Hospital.
Il primo autore dello studio è Yuxuan Liao, affiancato da Salvador Gallegos-Martínez, Xiao Kuang e Yipu Du.
Alla ricerca hanno quindi partecipato studiosi della University of Notre Dame, del Brigham and Women’s Hospital, della Harvard Medical School, della University of Wisconsin-Madison, dell’Harvard Stem Cell Institute e del Broad Institute of MIT and Harvard.
Il lavoro scientifico è stato pubblicato su Nature Chemical Engineering.
Perché stampare i capillari è molto più difficile che stampare i vasi più grandi
La capacità di costruire strutture biologiche tridimensionali non dipende soltanto dalla possibilità di posizionare cellule e biomateriali nella forma desiderata.
Un tessuto spesso ha bisogno di una rete interna capace di trasportare ossigeno, nutrienti e altre sostanze e di allontanare i prodotti del metabolismo cellulare.
Nel corpo umano questo compito viene svolto attraverso una struttura gerarchica che parte da arterie e vene di dimensioni relativamente grandi, prosegue attraverso vasi sempre più piccoli e termina nei capillari.
Riprodurre artificialmente questa gerarchia è difficile perché una singola tecnologia di bioprinting deve affrontare esigenze apparentemente contrastanti.
Le tecniche di estrusione sono adatte alla produzione di strutture tridimensionali relativamente grandi e possono depositare rapidamente quantità importanti di materiale, ma la loro risoluzione diventa limitante quando occorre scendere alla scala di pochi micrometri.
Tecniche con una risoluzione più elevata possono invece creare dettagli molto piccoli, ma diventano meno adatte alla costruzione rapida di volumi di tessuto più grandi.
Il gruppo della University of Notre Dame ha quindi scelto di non affidarsi a una sola tecnologia.
Due sistemi di stampa 3D utilizzati nello stesso processo
La soluzione sviluppata dai ricercatori combina aerosol jet printing e stampa per estrusione.
La stampa per estrusione viene utilizzata per costruire la matrice tridimensionale del tessuto. In questo caso i ricercatori hanno impiegato una matrice a base di GelMA, gelatin methacryloyl, un materiale molto utilizzato nella biofabbricazione di strutture morbide.
All’interno di questa matrice vengono successivamente definite le strutture destinate a diventare i canali vascolari.
Per creare i dettagli più piccoli entra in gioco l’aerosol jet printing.
Invece di spingere un filamento relativamente spesso attraverso un ugello come avviene nella normale estrusione, la tecnologia aerosol jet genera e controlla un flusso estremamente fine di materiale.
Il gruppo ha utilizzato questa tecnologia per depositare filamenti sacrificali di gelatina all’interno della struttura.
Questi filamenti svolgono il ruolo di stampo temporaneo.
Una volta completato il costrutto, il materiale sacrificale viene rimosso, lasciando all’interno dell’idrogel una rete di canali vuoti.
Il risultato è quindi una struttura tridimensionale attraversata da passaggi che possono successivamente essere perfusi e colonizzati da cellule.
Da centinaia di micrometri fino a 5,6 micrometri
Uno degli aspetti più importanti della ricerca è la possibilità di modificare la dimensione dei canali durante lo stesso processo produttivo.
I ricercatori hanno realizzato strutture con dimensioni che vanno da centinaia di micrometri fino alla scala dei capillari.
Nelle prove con strutture lineari sono stati prodotti canali con larghezze comprese indicativamente tra 40 e 140 micrometri.
Il sistema è stato utilizzato anche per riprodurre una geometria simile a una stenosi, cioè un restringimento localizzato del vaso.
In altre configurazioni sono state realizzate reti vascolari ramificate bidimensionali con canali di circa 9 micrometri.
Utilizzando un ugello da 50 micrometri per l’aerosol jet printing, il gruppo ha inoltre dimostrato la produzione di un canale largo circa 5,6 micrometri.
Questo valore è particolarmente significativo perché porta la fabbricazione diretta nella stessa scala dimensionale della microcircolazione biologica.
Non si tratta però di un semplice esercizio di miniaturizzazione
Produrre un singolo canale estremamente sottile non sarebbe sufficiente per risolvere il problema della vascolarizzazione dei tessuti.
Nel corpo umano i vasi sanguigni non sono tubi isolati. Formano reti ramificate nelle quali diametri, direzioni e punti di biforcazione cambiano continuamente.
I ricercatori hanno quindi utilizzato il sistema ibrido per costruire geometrie progressivamente più complesse.
Il metodo ha consentito la realizzazione di condotti unidimensionali, reti bidimensionali e strutture gerarchiche tridimensionali.
In una delle dimostrazioni è stata prodotta una rete che parte da un canale di circa 237 micrometri per dividersi progressivamente in 19 ramificazioni di circa 50 micrometri.
I ricercatori hanno inoltre realizzato reti tridimensionali con canali collocati a differenti livelli all’interno della matrice, verificandone il percorso mediante fluidi fluorescenti.
Questo passaggio è importante perché dimostra che la tecnologia non è limitata alla produzione di semplici microcanali su una superficie piana.
Il machine learning controlla un processo molto sensibile
Scendere sotto i 10 micrometri introduce anche un altro problema: variazioni molto piccole dei parametri di processo possono produrre differenze rilevanti nelle dimensioni finali.
Nell’aerosol jet printing il risultato dipende da variabili come le portate del gas che trasporta l’aerosol e del gas di focalizzazione, oltre alle caratteristiche del materiale e agli altri parametri operativi.
Individuare manualmente la combinazione corretta attraverso una successione di prove potrebbe richiedere numerosi esperimenti.
Per questo motivo il gruppo della University of Notre Dame ha integrato nel processo un sistema di ottimizzazione basato sul machine learning.
In particolare è stata utilizzata una forma di ottimizzazione bayesiana vincolata, che permette al sistema di analizzare il rapporto tra parametri di stampa e geometria ottenuta e di individuare più rapidamente le condizioni necessarie per raggiungere una determinata larghezza del canale.
L’intelligenza artificiale non viene quindi utilizzata per generare automaticamente il modello biologico, ma come strumento di controllo e ottimizzazione del processo produttivo.
Questo aspetto potrebbe diventare importante quando le geometrie da realizzare diventano più complesse e comprendono numerosi diametri differenti.
Dai microcanali ai vasi rivestiti di cellule
La parte biologica dell’esperimento rappresenta un passaggio fondamentale.
Un canale vuoto all’interno di un idrogel non può infatti essere considerato equivalente a un capillare.
I ricercatori hanno quindi introdotto cellule endoteliali in alcuni dei canali stampati.
Le cellule endoteliali sono quelle che, nell’organismo, rivestono la superficie interna dei vasi sanguigni e costituiscono l’interfaccia tra il sangue e i tessuti circostanti.
Durante gli esperimenti le cellule hanno aderito alle pareti dei canali e hanno continuato a proliferare, arrivando a formare uno strato cellulare continuo.
Le analisi hanno mostrato una buona vitalità cellulare e la formazione di monostrati endoteliali lungo le superfici interne.
Il gruppo ha inoltre studiato la permeabilità dei canali mediante molecole fluorescenti.
La presenza dello strato endoteliale ha ridotto la permeabilità rispetto ai canali privi di cellule, indicando la formazione di una barriera con caratteristiche funzionali simili, per alcuni aspetti, a quelle dell’endotelio biologico.
Perché la permeabilità è un parametro importante
La parete di un vaso sanguigno non è semplicemente un rivestimento passivo.
L’endotelio controlla lo scambio di sostanze tra il sangue e i tessuti e risponde a stimoli chimici e meccanici.
Per questo motivo verificare che le cellule aderiscano al canale non è sufficiente.
È necessario capire se riescono a creare una barriera continua e se il comportamento della struttura cambia in presenza dello strato cellulare.
I test sulla permeabilità realizzati dal gruppo rappresentano quindi un passaggio verso la creazione di modelli vascolari che non riproducano solamente la geometria dei vasi, ma anche alcune delle loro funzioni.
Capillari stampati, ma non ancora organi artificiali
Il risultato non significa che la University of Notre Dame abbia già stampato un sistema circolatorio umano completo o un organo pronto per essere trapiantato.
La distinzione è importante.
I ricercatori hanno sviluppato una piattaforma di fabbricazione che permette di costruire microcanali gerarchici con dimensioni compatibili con quelle dei capillari e di rivestire alcuni di questi canali con cellule endoteliali.
Per trasformare questa tecnologia in un organo artificiale completo sarà necessario integrare reti vascolari molto più estese con differenti popolazioni cellulari, garantire una perfusione stabile per periodi prolungati e ottenere una maturazione biologica adeguata del tessuto.
Sarà inoltre necessario verificare il comportamento dei costrutti in condizioni fisiologiche sempre più complesse.
Il risultato va quindi considerato come un avanzamento nella tecnologia necessaria per costruire tessuti vascolarizzati, piuttosto che come la produzione di un organo già utilizzabile clinicamente.
Una possibile applicazione negli organ-on-chip
Le applicazioni più vicine non riguardano necessariamente il trapianto di organi.
Reti vascolari artificiali controllabili con precisione potrebbero essere utilizzate per sviluppare modelli organ-on-chip e vessel-on-chip, nei quali cellule umane vengono coltivate all’interno di microambienti progettati per riprodurre specifiche funzioni dell’organismo.
Una rete capillare stampata potrebbe permettere di studiare il passaggio di farmaci attraverso la parete dei vasi, l’infiammazione, la risposta dell’endotelio, la formazione di trombi o il comportamento delle cellule tumorali durante il passaggio dal sangue ai tessuti.
La possibilità di controllare direttamente il diametro di ogni canale permette inoltre di creare modelli nei quali la geometria diventa una variabile sperimentale.
I ricercatori hanno già mostrato questa capacità realizzando strutture con restringimenti controllati.
Modelli personalizzati per lo sviluppo dei farmaci
Nel lungo periodo, una combinazione tra bioprinting e cellule provenienti da specifici pazienti potrebbe permettere di costruire modelli biologici personalizzati.
Invece di valutare un farmaco soltanto su una coltura cellulare bidimensionale, sarebbe possibile osservarne il comportamento in un ambiente tridimensionale attraversato da una microcircolazione artificiale.
Questo tipo di piattaforma potrebbe trovare applicazione nella ricerca farmacologica e nella medicina di precisione.
Non elimina la necessità degli studi clinici, ma può fornire modelli preclinici più complessi rispetto alle colture cellulari convenzionali.
Il legame tra fabbricazione additiva e intelligenza artificiale
Lo studio mette in evidenza anche una tendenza più generale della manifattura additiva.
Aumentando la risoluzione, il numero dei materiali e la complessità delle geometrie, diventa sempre più difficile gestire il processo attraverso parametri definiti esclusivamente per tentativi.
Il machine learning può essere utilizzato per creare una relazione tra i parametri della macchina e il risultato effettivamente ottenuto.
Nel caso della ricerca della University of Notre Dame, l’obiettivo è raggiungere la larghezza desiderata del microcanale senza dover eseguire una lunga sequenza manuale di prove.
Questa logica può avere applicazioni anche al di fuori del bioprinting e rientra nello sviluppo di sistemi di produzione capaci di adattare automaticamente i propri parametri sulla base del risultato richiesto.
Un progetto che proseguirà con il sostegno del NIH
La ricerca ha ricevuto sostegno da programmi del National Institutes of Health e della National Science Foundation.
Il gruppo guidato da Yanliang Zhang alla University of Notre Dame e i collaboratori coordinati da Yu Shrike Zhang presso Harvard Medical School e Brigham and Women’s Hospital stanno lavorando allo sviluppo di una versione più avanzata della piattaforma ibrida.
L’obiettivo di lungo periodo è aumentare scala e complessità delle strutture realizzabili, avvicinando la tecnologia alla fabbricazione di tessuti dotati di una rete vascolare gerarchica completa.
Tra i tessuti e gli organi di maggiore interesse figurano strutture cardiache, renali ed epatiche, nelle quali la presenza di una vascolarizzazione capillare efficiente costituisce una condizione essenziale.
Il vero valore del risultato è nella continuità tra scale diverse
La caratteristica più interessante della tecnologia sviluppata dalla University of Notre Dame non è quindi soltanto il record dimensionale di 5,6 micrometri.
L’aspetto centrale è l’integrazione di scale differenti all’interno dello stesso processo.
La stampa per estrusione fornisce velocità e volume necessari alla costruzione della matrice tridimensionale, mentre l’aerosol jet printing introduce dettagli molto più piccoli.
Il machine learning aggiunge un sistema di ottimizzazione capace di controllare i parametri necessari a ottenere geometrie diverse.
Infine, l’introduzione delle cellule endoteliali permette di trasformare i microcanali da semplici elementi geometrici a strutture con alcune proprietà funzionali tipiche dei vasi biologici.
È questa combinazione tra fabbricazione additiva, biomateriali, biologia cellulare e intelligenza artificiale a rendere il progetto particolarmente interessante.
Il passaggio dagli attuali modelli sperimentali a tessuti grandi e completamente vascolarizzati richiederà ancora lavoro, ma la capacità di costruire in modo controllato reti che scendono dalla scala di centinaia di micrometri fino a quella dei capillari elimina uno dei limiti tecnici che hanno accompagnato per anni la biostampa tridimensionale.
Questo articolo è stato redatto con il supporto di strumenti di intelligenza artificiale (AI)
