Bioprinting 3D di astrociti corticali murini per l’ingegneria di tessuti simili ai neuroni
Bruna AG de Melo 1, Elisa M Cruz 2, Tais N Ribeiro 2, Maya V Mundim 2, Marimelia A Porcionatto 2
Gli astrociti sono cellule gliali con un ruolo essenziale nel sistema nervoso centrale (SNC), compreso il supporto neuronale e la funzionalità. Queste cellule rispondono anche alle lesioni neurali e agiscono per proteggere il tessuto da eventi degenerativi. Gli studi in vitro sulla funzionalità degli astrociti sono importanti per chiarire i meccanismi coinvolti in tali eventi e contribuire allo sviluppo di terapie per il trattamento dei disturbi neurologici. Questo protocollo descrive un metodo per biofabbricare una struttura tissutale simile a quella neurale ricca di astrociti mediante bioprinting 3D bioink carico di astrociti. In questo lavoro è stata utilizzata una biostampante 3D basata sull’estrusione e gli astrociti sono stati estratti dalle cortecce cerebrali dei cuccioli di topo C57Bl/6. Il bioinchiostro è stato preparato miscelando astrociti corticali fino al passaggio 3 in una soluzione di biomateriale composta da gelatina, gelatina-metacriloile (GelMA), e fibrinogeno, integrato con laminina, che presentava condizioni ottimali di bioprinting. Le condizioni di bioprinting 3D hanno ridotto al minimo lo stress cellulare, contribuendo all’elevata vitalità degli astrociti durante il processo, in cui il 74,08% ± 1,33% delle cellule era vitale subito dopo il bioprinting. Dopo 1 settimana di incubazione, la vitalità degli astrociti è aumentata significativamente all’83,54% ± 3,00%, indicando che il costrutto 3D rappresenta un microambiente adatto per la crescita cellulare. La composizione del biomateriale ha consentito l’attaccamento cellulare e ha stimolato il comportamento astrocitico, con cellule che esprimono la specifica proteina acida fibrillare gliale (GFAP) marcatore degli astrociti e che possiedono la tipica morfologia astrocitica. Questo protocollo riproducibile fornisce un metodo prezioso per biofabbricare un tessuto simile a un neurone 3D ricco di astrociti che assomiglia alle cellule.
Un gruppo di ricercatori affiliato all’Università Federale di San Paolo (UNIFESP) in Brasile ha sviluppato un protocollo per la stampa tridimensionale (3D) delle cellule neurali. Il bioink era costituito da polimeri naturali che consentivano agli astrociti (un tipo di cellula cerebrale) di sopravvivere per almeno 14 giorni in laboratorio dopo essere passati attraverso una stampante 3D. La procedura ha prodotto un modello più simile al tessuto neurale rispetto al materiale ottenuto dai protocolli esistenti, che fanno crescere le cellule in due dimensioni. Lo studio è stato sostenuto da FAPESP . Morfologia di un astrocita biostampato: il nucleo cellulare colorato in blu e il resto colorato in rosso mostrano uno stato molto simile a quello osservato nel tessuto neurale “Nell’organismo, le cellule sono tridimensionali, ma quando vengono coltivate in laboratorio si trovano sopra la plastica e sotto il mezzo di coltura [ un insieme di sostanze che consentono la sopravvivenza e la proliferazione cellulare ]. Questo è molto diverso dall’organizzazione naturale di tessuti o organi, dove le cellule sono disposte in tre dimensioni. Il bioink che abbiamo sviluppato tenta di riprodurre la relazione tra la cellula e il microambiente e altre cellule. È un sistema intermedio tra la cultura 2D e gli esperimenti con gli animali”, ha affermato Marimélia Porcionatto , professoressa presso la Facoltà di medicina dell’UNIFESP (EPM) e ultima autrice dell’articolo. Gli astrociti, le cellule più grandi e abbondanti del sistema nervoso centrale, svolgono un ruolo chiave in diversi processi neurologici e nelle malattie che colpiscono il cervello. La procedura standardizzata dal gruppo UNIFESP può essere adattata ai fini dello studio di altri tipi cellulari. Il gruppo lo sta attualmente utilizzando per analizzare astrociti e neuroni infettati da SARS-CoV-2, il virus che causa il COVID-19, nell’ambito di un altro progetto finanziato da FAPESP. “Stiamo testando diversi biomateriali per la compatibilità con le cellule del tessuto neurale: neuroni e cellule staminali neurali, nonché astrociti. La biostampa è una tecnica recente nell’ingegneria dei tessuti e le cellule del tessuto neurale sono particolarmente sensibili, quindi questo protocollo sarà utile sia per i ricercatori che lavorano con astrociti e altre cellule cerebrali sia per coloro che lavorano con altri tipi di cellule”, ha affermato Bruna Alice Gomes de Melo , primo autore dell’articolo. Lo studio è stato condotto durante la sua ricerca post-dottorato presso EPMUNIFESP . Il gruppo guidato da Porcionatto ha sviluppato il protocollo con cellule murine ma ha incluso materiali biocompatibili che possono essere adattati per l’uso in studi con cellule umane. Oltre agli studi sulle malattie del sistema nervoso centrale in un formato molto simile a quello del cervello, i ricercatori sono alla ricerca di materiali che possano essere utilizzati in futuro per riparare le aree cerebrali danneggiate da lesioni cerebrali traumatiche o ictus, ad esempio . Ricetta Il bioink è costituito da materie prime disponibili in commercio come la laminina, un componente della matrice extracellulare (molecole situate tra le cellule), in questo caso estratta dalle mucche. La ricetta include anche fattori di crescita che consentono alle cellule di sopravvivere e prosperare nel mezzo di coltura. Un altro ingrediente importante è la gelatina metacriloile (GelMA), un materiale che ha dimostrato PT ES Pesquise I ricercatori di un’università brasiliana sviluppano un protocollo per la stampa 3D di cellule cerebrali di essere versatile per l’ingegneria dei tessuti, la somministrazione di farmaci e le applicazioni di stampa 3D. È commercializzato all’estero, ma i ricercatori lo hanno prodotto in laboratorio a un costo molto inferiore rispetto a GelMA importato. Melo è stata formata per produrlo mentre svolgeva un dottorato di ricerca presso l’Università di Campinas (UNICAMP) nello stato di San Paolo e durante uno stage nell’ambito del programma Harvard-MIT in Scienze e tecnologie della salute (HST) negli Stati Uniti, con un borsa di studio FAPESP. “In altre composizioni, molte delle cellule sono sopravvissute allo stress della stampa 3D per un certo periodo, ma la morfologia degli astrociti non era compatibile con il tessuto vivente. GelMA e laminina erano essenziali”, ha detto Melo. Dopo che il bioinchiostro gelatinoso è passato attraverso l’ugello di espulsione della stampante, viene depositato a strati. Pochi giorni dopo, gli astrociti iniziano a replicarsi e si comportano in modo simile a quello osservato nel tessuto nervoso. L’obiettivo ora è aumentare la complessità del protocollo. Oltre agli astrociti, lo studio relativo a SARS-CoV-2 ha utilizzato un bioink con neuroni e un terzo materiale che combina entrambi i tipi di cellule. I ricercatori hanno in programma di includere le cellule staminali neurali nella miscela nel prossimo futuro. “L’idea è di avvicinarsi il più possibile alla complessità del tessuto neurale”, ha detto Porcionatto. “Quando questi protocolli saranno completamente convalidati con cellule di topo, saremo in grado di svilupparne altri con cellule umane. Saranno utili per una varietà di studi, come sperimentazioni di farmaci candidati, test per identificare i geni espressi durante lo sviluppo del cervello e modelli di malattie, tra gli altri”.
Immagine tramite FAPESP/archivio dei ricercatori.