Un gruppo di ricercatori di Scripps Research ha ricostruito ad alta risoluzione il modo in cui la proteina umana Argonaute 2 si prepara a tagliare una molecola di RNA messaggero. Lo studio chiarisce un passaggio fondamentale dell’interferenza a RNA e offre indicazioni utili per progettare farmaci siRNA con maggiore efficacia e specificità.
Il risultato non consiste soltanto in una nuova immagine della proteina. I ricercatori hanno dimostrato che il riconoscimento della sequenza bersaglio non è sufficiente ad attivare il taglio. Prima che la reazione avvenga, il complesso formato dall’RNA guida e dall’RNA bersaglio deve assumere una geometria precisa, deformandosi all’interno di Argonaute 2.
Questa deformazione porta il legame chimico da recidere nella posizione corretta rispetto al centro catalitico della proteina. Se la doppia elica di RNA rimane troppo rigida o non raggiunge la conformazione richiesta, Argonaute 2 può riconoscere il bersaglio senza riuscire a tagliarlo in modo efficiente.
La ricerca è stata condotta da Sucharita Sarkar, Luca F. R. Gebert e Ian J. MacRae, appartenenti al Department of Integrative Structural and Computational Biology di Scripps Research. Il lavoro è stato pubblicato il 24 giugno 2026 sulla rivista Nature Structural & Molecular Biology con il titolo “Catalytic activation of human Argonaute 2 requires RNA duplex deformation”.
Il progetto ha ricevuto finanziamenti dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health ed è stato sostenuto attraverso un accordo di ricerca con Eli Lilly and Company.
L’interferenza a RNA come sistema naturale di controllo dei geni
L’interferenza a RNA, indicata con la sigla RNAi, è un meccanismo attraverso il quale le cellule possono ridurre l’espressione di determinati geni.
L’informazione contenuta nel DNA viene normalmente trascritta in RNA messaggero. La cellula utilizza poi questo RNA come istruzione per produrre una proteina. Se l’RNA messaggero viene eliminato o reso inutilizzabile, la produzione della proteina diminuisce.
I piccoli RNA interferenti, o siRNA, sfruttano questo principio. Sono brevi molecole di RNA a doppio filamento progettate per riconoscere un RNA messaggero specifico. Una volta entrati nella cellula, vengono caricati in un complesso proteico chiamato RISC, acronimo di RNA-induced silencing complex.
Al centro del complesso RISC si trova Argonaute 2. La proteina trattiene uno dei due filamenti del siRNA, chiamato filamento guida, e lo utilizza come riferimento per individuare gli RNA messaggeri complementari.
Quando viene riconosciuto un bersaglio adatto, Argonaute 2 può tagliare l’RNA messaggero. I frammenti vengono poi degradati dai normali sistemi cellulari e il gene interessato produce una quantità inferiore della propria proteina.
La scoperta dell’interferenza a RNA valse ad Andrew Z. Fire e Craig C. Mello il Premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina del 2006. Da allora il fenomeno è passato dalla biologia di base allo sviluppo di medicinali destinati a malattie genetiche, metaboliche, cardiovascolari ed ematologiche.
Argonaute 2 non è una semplice forbice molecolare
Argonaute 2 viene spesso descritta come una forbice molecolare, ma il suo funzionamento è più complesso di un taglio eseguito appena viene incontrata la sequenza corretta.
La proteina deve prima caricare il filamento guida, conservarlo in una posizione stabile e rendere accessibile la regione che avvia il riconoscimento del bersaglio.
Una porzione iniziale del filamento guida, chiamata regione “seed”, svolge il ruolo di punto di contatto. Questa zona esamina gli RNA presenti nella cellula e forma coppie di basi con quelli che mostrano una complementarità sufficiente.
Il primo contatto non determina automaticamente il taglio. Il riconoscimento deve estendersi verso la parte centrale del filamento guida. Soltanto allora il complesso può passare da uno stato di ricerca a una configurazione cataliticamente attiva.
Il problema per i ricercatori era osservare questa fase intermedia. Argonaute 2 si muove tra conformazioni differenti e lo stato immediatamente precedente al taglio dura per un tempo molto breve.
Le strutture ottenute in passato avevano mostrato la proteina isolata, associata al solo filamento guida oppure legata a RNA in configurazioni non pienamente catalitiche. Mancava una rappresentazione dettagliata della macchina umana pronta a recidere il bersaglio.
La criomicroscopia elettronica cattura uno stato transitorio
Sucharita Sarkar, Luca F. R. Gebert e Ian J. MacRae hanno utilizzato la criomicroscopia elettronica, o cryo-EM, per osservare Argonaute 2 associata al filamento guida e all’RNA bersaglio.
Nella cryo-EM il campione viene congelato rapidamente in uno strato sottile di ghiaccio vetroso. Le molecole rimangono immobilizzate in numerosi orientamenti e vengono osservate mediante un fascio di elettroni.
Le immagini ottenute da un grande numero di particelle vengono elaborate al computer per ricostruire la struttura tridimensionale del complesso. Il metodo permette di distinguere regioni della proteina, segmenti di RNA e, nelle ricostruzioni di qualità più elevata, la disposizione delle singole basi e delle catene laterali degli amminoacidi.
Per impedire ad Argonaute 2 di completare immediatamente il taglio e perdere la configurazione che si voleva osservare, il gruppo di Scripps Research ha introdotto mutazioni mirate nella zona che trattiene l’estremità 3’ del filamento guida.
Tra le varianti analizzate figuravano le sostituzioni F294A e R315V/H316A. Queste modifiche hanno facilitato il rilascio dell’estremità del filamento guida dalla regione PAZ di Argonaute 2, permettendo al duplex guida-bersaglio di estendersi nella fessura centrale della proteina.
I ricercatori hanno poi confrontato strutture catalitiche e non catalitiche, verificando con esperimenti biochimici che la geometria osservata non fosse soltanto un effetto artificiale delle mutazioni utilizzate per stabilizzare il campione.
Il duplex di RNA deve deformarsi per entrare nel centro attivo
La ricostruzione ottenuta da Scripps Research mostra che l’RNA guida e l’RNA bersaglio non rimangono in una doppia elica regolare.
Argonaute 2 esercita una serie coordinata di interazioni che piegano e comprimono il duplex. La regione centrale si allarga, mentre un’altra porzione viene spinta all’interno della fessura della proteina.
L’allargamento del solco maggiore nella zona centrale permette di posizionare il fosfato da tagliare vicino agli elementi catalitici. Allo stesso tempo, la compressione verso la regione supplementare stabilizza il duplex all’interno della struttura di Argonaute 2.
Il movimento non è casuale. Diverse parti della proteina entrano in contatto con il duplex in una sequenza coordinata. La forma dell’RNA diventa quindi un elemento attivo della catalisi e non un semplice supporto per il riconoscimento delle basi.
La complementarità tra il siRNA e il bersaglio rimane indispensabile, ma non rappresenta l’unico criterio. Due sequenze con un numero simile di coppie corrette possono comportarsi in modo diverso se una delle due riesce ad assumere più facilmente la conformazione richiesta da Argonaute 2.
Questo risultato fornisce una spiegazione strutturale a un problema conosciuto nello sviluppo dei siRNA: alcune molecole funzionano molto bene, mentre altre, apparentemente altrettanto complementari al bersaglio, mostrano una capacità di silenziamento inferiore.
La piega dopo il nucleotide guida numero 6
Uno dei cambiamenti osservati riguarda una piega collocata dopo il sesto nucleotide del filamento guida, indicato nello studio come g6.
Durante la fase iniziale di riconoscimento, la regione seed del filamento guida assume una disposizione adatta a esaminare rapidamente gli RNA presenti nella cellula. Questa conformazione favorisce il primo contatto, ma non è ancora sufficiente per attivare il taglio.
Quando l’appaiamento con il bersaglio si estende oltre la regione seed, il duplex deve modificare la propria forma. La piega successiva a g6 interrompe la configurazione utilizzata durante il semplice riconoscimento e favorisce l’ingresso nella conformazione catalitica.
La proteina utilizza quindi un cambiamento geometrico come meccanismo di controllo. Un RNA che forma soltanto un appaiamento limitato può essere riconosciuto, ma non riesce necessariamente a superare il passaggio che autorizza il taglio.
Questo sistema contribuisce alla selettività di Argonaute 2. La proteina non reagisce allo stesso modo a qualsiasi contatto parziale, riducendo la probabilità di recidere RNA che condividono soltanto una breve porzione di sequenza con il filamento guida.
Lisina 709 come controllo dell’attivazione
La struttura ha chiarito il ruolo della lisina 709, indicata come K709.
Nelle conformazioni non catalitiche K709 si trova lontana dalla posizione necessaria per sostenere il taglio. Quando il duplex guida-bersaglio si estende e assume la forma deformata, la lisina viene riposizionata nel centro attivo.
K709 funziona quindi come un punto di controllo molecolare. La sua entrata nella configurazione catalitica dipende dalla corretta deformazione dell’RNA e segnala che l’appaiamento ha superato la fase iniziale di riconoscimento.
La lisina non sostituisce gli amminoacidi della tetrade catalitica già conosciuta, ma contribuisce a organizzare l’ambiente nel quale avviene la reazione.
Il risultato aiuta a spiegare perché il semplice avvicinamento del fosfato al centro attivo non sia sufficiente. L’intera architettura deve essere organizzata in modo che RNA, amminoacidi catalitici e ioni metallici assumano le posizioni necessarie.
Arginina 710 e l’importanza del nucleotide t10
Accanto a K709, il gruppo di Scripps Research ha individuato una funzione specifica per l’arginina 710, o R710.
R710 interagisce con la regione del bersaglio vicina al decimo nucleotide, indicato come t10. La natura della base presente in quella posizione influenza la disposizione dell’arginina e la velocità con cui Argonaute 2 esegue il taglio.
Lo studio mostra che la presenza di una pirimidina in t10 può favorire un orientamento di R710 compatibile con una catalisi più efficiente. Le pirimidine comprendono citosina e uracile, mentre adenina e guanina appartengono al gruppo delle purine.
Questa osservazione offre una spiegazione molecolare a regole empiriche emerse durante anni di selezione sperimentale dei siRNA.
I progettisti avevano notato che alcune basi erano preferibili in determinate posizioni, ma non era sempre chiaro se l’effetto dipendesse dalla stabilità della doppia elica, dal caricamento nel complesso RISC o dalla fase di taglio.
La struttura di Argonaute 2 mostra che almeno una parte di queste differenze deriva dal modo in cui il nucleotide bersaglio interagisce con il centro catalitico.
Perché la sequenza da sola non basta
Per silenziare un gene, i ricercatori possono progettare numerosi siRNA complementari a differenti punti dello stesso RNA messaggero.
Un gene di dimensioni medie può offrire centinaia o migliaia di possibili sequenze bersaglio. Solo una parte dei siRNA progettati raggiunge però livelli di attività adeguati.
L’efficacia dipende da più fattori: accessibilità dell’RNA messaggero, struttura locale del bersaglio, stabilità chimica del siRNA, scelta del filamento guida, caricamento in Argonaute 2, distribuzione nei tessuti e presenza di sequenze simili in altri RNA.
Il lavoro di Scripps Research aggiunge un ulteriore criterio: la capacità del duplex guida-bersaglio di deformarsi nella maniera richiesta dal centro catalitico.
Una sequenza può essere perfettamente complementare, ma generare una struttura troppo rigida. Un’altra può consentire più facilmente l’allargamento del solco centrale, la piega dopo g6 e il corretto posizionamento di K709 e R710.
La progettazione di un siRNA non dovrebbe quindi considerare soltanto l’energia complessiva dell’appaiamento. Dovrebbe valutare anche la distribuzione locale della flessibilità e l’effetto delle singole basi sulla geometria tridimensionale.
Le modifiche chimiche possono aiutare o ostacolare il taglio
I siRNA terapeutici non vengono normalmente somministrati come semplici molecole di RNA naturale.
L’RNA privo di protezione può essere degradato rapidamente dagli enzimi presenti nel sangue e nei tessuti. Può inoltre attivare risposte immunitarie o essere eliminato prima di raggiungere le cellule bersaglio.
Le aziende farmaceutiche utilizzano quindi modifiche chimiche sullo zucchero, sulle basi e sullo scheletro fosfato. Questi interventi aumentano la stabilità, riducono il riconoscimento immunitario e possono migliorare la permanenza del farmaco nell’organismo.
La nuova struttura indica però che una modifica utile per la stabilità potrebbe avere un effetto negativo se irrigidisce la regione che deve deformarsi all’interno di Argonaute 2.
Le modifiche collocate nella parte centrale del duplex richiedono una valutazione specifica. Se impediscono l’allargamento del solco o la formazione della piega necessaria, possono ridurre il taglio anche quando il siRNA viene consegnato correttamente alla cellula.
Al contrario, modifiche capaci di conservare o favorire la geometria attiva potrebbero migliorare la potenza del farmaco.
Il contributo dello studio non consiste nell’indicare una formulazione pronta per l’impiego clinico, ma nel fornire criteri strutturali con cui confrontare le modifiche chimiche disponibili.
Dalla selezione empirica alla progettazione razionale
Lo sviluppo dei siRNA ha richiesto estese campagne di screening. Per ogni gene vengono sintetizzate numerose sequenze, testate in cellule e poi selezionate in base all’efficacia e alla specificità.
I modelli informatici hanno ridotto il numero di candidati da provare, ma le previsioni rimangono imperfette. Molti algoritmi si basano sulla composizione delle basi, sulla stabilità termodinamica, sull’accessibilità dell’RNA bersaglio e sui dati raccolti da esperimenti precedenti.
La struttura ottenuta da Scripps Research permette di aggiungere parametri fisici più precisi.
Un futuro sistema di progettazione potrebbe valutare se una determinata sequenza è compatibile con la piega dopo g6, se permette l’espansione del solco centrale e se presenta nella posizione t10 una base favorevole all’interazione con R710.
Potrebbe inoltre simulare l’effetto delle modifiche chimiche sulla flessibilità del duplex e scartare prima della sintesi i candidati che hanno poche probabilità di raggiungere la conformazione catalitica.
La progettazione razionale non eliminerà le prove sperimentali, perché distribuzione, tossicità e comportamento nell’organismo non possono essere previsti dalla sola struttura di Argonaute 2. Può però ridurre il numero di molecole da produrre e migliorare la qualità dei candidati che entrano nelle fasi successive.
I farmaci siRNA già approvati
Al momento della pubblicazione dello studio, sette medicinali basati su siRNA avevano ottenuto l’approvazione della Food and Drug Administration statunitense.
Il primo è stato Onpattro, basato su patisiran e sviluppato da Alnylam Pharmaceuticals. Approvato nel 2018, riduce la produzione di transtiretina per il trattamento della polineuropatia associata all’amiloidosi ereditaria mediata dalla transtiretina.
Alnylam Pharmaceuticals ha portato sul mercato anche Givlaari, basato su givosiran per la porfiria epatica acuta; Oxlumo, basato su lumasiran per l’iperossaluria primaria di tipo 1; e Amvuttra, basato su vutrisiran per patologie legate alla transtiretina.
Novartis commercializza Leqvio, basato su inclisiran. Il farmaco indirizza il complesso di silenziamento verso l’RNA messaggero di PCSK9, riducendo la produzione della proteina e contribuendo alla diminuzione del colesterolo LDL.
Dopo la prima somministrazione e una seconda dose a tre mesi, Leqvio viene somministrato ogni sei mesi. Questa frequenza mostra uno dei possibili vantaggi delle terapie siRNA: il silenziamento può durare più a lungo rispetto alla permanenza del farmaco libero nel sangue.
Novo Nordisk commercializza Rivfloza, basato su nedosiran e destinato all’iperossaluria primaria. La molecola era stata sviluppata attraverso Dicerna Pharmaceuticals, società acquisita da Novo Nordisk.
Sanofi, attraverso Genzyme Corporation, ha ottenuto nel 2025 l’approvazione di Qfitlia, basato su fitusiran per la profilassi delle emorragie nell’emofilia A o B, con o senza inibitori dei fattori VIII o IX.
I sette farmaci mostrano che l’interferenza a RNA non è più soltanto una piattaforma sperimentale. Rimane però concentrata soprattutto su bersagli raggiungibili nel fegato, dove diversi siRNA possono essere trasportati attraverso coniugati contenenti N-acetilgalattosamina, abbreviata in GalNAc.
Il problema della distribuzione nei tessuti
La comprensione del taglio eseguito da Argonaute 2 affronta una parte importante dello sviluppo dei farmaci siRNA, ma non risolve tutte le difficoltà.
Una molecola efficace deve raggiungere l’organo corretto, attraversare le barriere biologiche, entrare nelle cellule e liberarsi nel citoplasma, dove si trova il complesso RISC.
Il fegato è diventato il principale bersaglio delle terapie siRNA perché gli epatociti possiedono recettori capaci di riconoscere i coniugati GalNAc. Questo sistema permette di indirizzare il farmaco con una relativa precisione.
Raggiungere cervello, muscolo, polmone, tumori solidi e altri tessuti è più complesso. Aziende farmaceutiche e società biotecnologiche stanno sviluppando nanoparticelle, ligandi, anticorpi coniugati e sistemi locali di somministrazione.
La nuova struttura di Argonaute 2 può contribuire a ottimizzare la molecola una volta entrata nella cellula. La distribuzione richiederà però piattaforme specifiche e valutazioni separate.
Un siRNA con una geometria catalitica favorevole non produce alcun effetto se non raggiunge il tessuto o rimane intrappolato all’interno degli endosomi.
Potenza e specificità devono essere considerate insieme
Aumentare la velocità di taglio non è l’unico obiettivo nella progettazione di un siRNA.
Il filamento guida può legarsi anche a RNA che non corrispondono perfettamente al bersaglio previsto. Alcuni appaiamenti parziali possono causare effetti fuori bersaglio, modificando l’espressione di geni non coinvolti nella malattia.
La geometria descritta da Scripps Research offre una possibile strada per distinguere meglio i bersagli pienamente complementari da quelli parziali.
Un siRNA potrebbe essere progettato in modo da raggiungere la conformazione catalitica soltanto quando incontra la sequenza corretta. Nei confronti di RNA simili, ma non identici, la presenza di un disallineamento potrebbe impedire la deformazione richiesta.
Le modifiche chimiche possono essere utilizzate anche per ridurre la stabilità di appaiamenti indesiderati nella regione seed o per introdurre una maggiore selettività in punti specifici.
L’obiettivo non è quindi ottenere le forbici molecolari più veloci in ogni situazione, ma controllare con precisione quando devono diventare attive.
Il ruolo di Eli Lilly and Company e le dichiarazioni degli autori
Il lavoro di Scripps Research è stato sostenuto attraverso un accordo di ricerca sponsorizzata con Eli Lilly and Company, oltre al finanziamento dei National Institutes of Health.
La partecipazione finanziaria di Eli Lilly and Company indica l’interesse industriale verso i criteri che regolano l’efficacia dei farmaci a RNA. Lo studio pubblicato non descrive però uno specifico candidato clinico di Eli Lilly and Company e non annuncia l’avvio di una sperimentazione sull’uomo.
Gli autori hanno dichiarato anche i possibili conflitti di interesse. Ian J. MacRae opera come consulente scientifico per City Therapeutics, società biotecnologica impegnata nello sviluppo di medicinali basati sull’interferenza a RNA. Sucharita Sarkar e Luca F. R. Gebert non hanno dichiarato interessi concorrenti.
Queste informazioni permettono di distinguere i risultati sperimentali dalle successive applicazioni commerciali. La ricerca è stata sottoposta a revisione tra pari, ma le sue indicazioni dovranno essere confermate durante lo sviluppo di molecole terapeutiche concrete.
Cosa dimostra lo studio e cosa resta da verificare
La ricerca dimostra che Argonaute 2 richiede una deformazione coordinata del duplex formato dal filamento guida e dall’RNA bersaglio.
Mostra inoltre il coinvolgimento della piega successiva al nucleotide g6, il riposizionamento della lisina K709 e il ruolo dell’arginina R710 nel riconoscimento della base presente in t10.
Questi elementi collegano la geometria dell’RNA alla velocità di taglio e forniscono una base strutturale per alcune regole già osservate durante la selezione dei siRNA.
Lo studio non dimostra che applicando queste regole si ottenga automaticamente un farmaco sicuro ed efficace. La cryo-EM osserva complessi molecolari purificati in condizioni controllate. L’ambiente cellulare comprende proteine, membrane, sistemi di degradazione e numerosi RNA potenzialmente concorrenti.
Le molecole progettate sulla base della struttura dovranno essere testate in cellule, modelli animali e sperimentazioni cliniche. Sarà necessario valutare durata dell’effetto, distribuzione, reazioni immunitarie, tossicità e interazioni fuori bersaglio.
La struttura costituisce quindi una mappa di progettazione, non una scorciatoia verso l’approvazione regolatoria.
Una base più solida per la prossima generazione di terapie a RNA
Il contributo di Scripps Research consiste nell’aver trasformato un insieme di osservazioni biochimiche in un modello tridimensionale del processo di attivazione.
Argonaute 2 non decide di tagliare soltanto leggendo la sequenza. Verifica anche se il duplex può assumere la forma necessaria. La proteina piega l’RNA, amplia la regione centrale, riposiziona specifici amminoacidi e porta il fosfato bersaglio davanti al proprio apparato catalitico.
Questa conoscenza può essere integrata negli algoritmi utilizzati da aziende farmaceutiche e società biotecnologiche per scegliere sequenze, modifiche chimiche e punti bersaglio.
Scripps Research, Eli Lilly and Company e le imprese attive nel settore dell’interferenza a RNA dispongono ora di informazioni più precise per collegare la struttura molecolare alla potenza del silenziamento.
Il passaggio dalla selezione per tentativi alla progettazione basata sulla geometria potrebbe ridurre il numero di candidati da esaminare e aiutare a sviluppare siRNA capaci di distinguere con maggiore precisione gli RNA patologici da quelli che devono rimanere intatti.
Questo articolo è stato redatto con il supporto di strumenti di intelligenza artificiale (AI)
